IRCCS Azienda Ospedaliera Universitaria San Martino – IST
Istituto Nazionale per la Ricerca sul Cancro

Largo Rosanna Benzi, 10 16132 GENOVA
U.O.C. Genetica Medica
(Direttore: Prof. Paola Mandich)

Ruolo delle Copy Number Variations (CNVs) nella patogenesi di malattie ereditarie: sviluppo e validazione di una nuova metodica per l’identificazione rapida ed efficiente di CNVs in un ampio spettro di malattie neurologiche

Razionale

Le  CNVs sono definite come frammenti di DNA, di lunghezza maggiore a 1 Kb, che variano nel numero di copie, rispetto ad un genoma di riferimento. Le variazione nel numero di copie del DNA hanno ormai un ruolo nella patogenesi di malattie mendeliane e di malattia complesse.

 

Le CNVs sono un meccanismo patogenetico comune nella malattia di Charcot-Marie-Tooth (CMT) , la più frequente tra le patologie ereditarie del sistema nervoso periferico. La CMT è caratterizzata da un’ampia variabilità clinica e da eterogeneità genetica, con più di 40 geni-malattia, identificati ad oggi. I riarrangiamenti genomici che coinvolgono il gene PMP22 sono causa della CMT1A, forma che rappresenta circa i 2/3 delle forme di CMT demielinizzanti. Recentemente le CNVs sono state associate ad altre forme di CMT associate a mutazioni nei geni MPZ, GJB1 e MNF2 (Hoyer, 2011; Gonzaga-Jaregui, 2010; Polke, 2011), permettendo di identificare quindi la CMT come disordine genomico.

La sclerosi laterale amiotrofica (SLA) è una malattia degenerativa causata dalla morte selettiva dei motoneuroni. Più di 10 geni sono associati a forme familiari e sporadiche di SLA e un recente lavoro ha indicato un possibile ruolo di rari riarrangiamenti genomici come fattori di rischio per lo sviluppo di SLA (Blauw, 2010).

Le CNVs possono essere identificate attraverso l’utilizzo di diverse metodiche di laboratorio (per esempio la MLPA, la CGH array e la qPCR), ciascuna caratterizzata da vantaggi e svantaggi e costi differenti.

Obiettivi

Obiettivo del progetto è la valutazione del contributo delle CNVs nella patogenesi di CMT e SLA mediante l’utilizzo di una nuova metodica: costum-design Multiplex Amplicon Quantitation (MAQ) assay.

Disegno dello studio

-          Selezione di pazienti con CMT e con SLA secondo i criteri diagnostici della letteratura internazionale

-          Selezione di un gruppo di controllo costituito da soggetti , paragonabili per età e per sesso, con esame neurologico negativo

-          Reclutamento dei partecipanti allo studio per entrambi i gruppi (pazienti e controlli) e raccolta del consenso alla partecipazione alla ricerca

-          Disegno di costum-design MAQ assay, specifico per ciascun gene da analizzare

-          Messa a punto e validazione della metodologia per ciascun gene

-          Analisi dei risultati e valutazione dei costi

Dati preliminari

In collaborazione con il laboratorio di Peter de Jonghe (Università di Anversa), che ha proposto questa tecnologia per lo studio di CNVs in patologie neurologiche (epilessie genetiche) (Suls, 2006),  il nostro gruppo ha utilizzato la MAQ per il completamento dell’analisi molecolare in una famiglia con CMT nella quale era stata identificata una mutazione nel gene GDAP1, in eterozigosi. Sebbene siano state descritte soprattutto mutazioni recessive di questo gene, in alcuni casi sono state identificate anche mutazioni dominanti. Nel caso della famiglia da noi analizzata, con diversi membri affetti in 3 generazioni, era necessario escludere la presenza di riarrangiamenti genomici a carico del secondo allele. L’utilizzo della MAQ ha permesso di escludere questa possibilità nella famiglia esaminata e quindi di confermare la causalità della mutazione identificata con effetto dominante (lavoro in preparazione).

La MAQ è stata utilizzata inoltre, dal nostro gruppo di ricerca, per l’analisi di un gene candidato per forme recessive di CMT. È in studio un paziente nel quale abbiamo identificata una delezione in eterozigosi.

Materiali e metodi

I pazienti saranno selezionati mediante l’utilizzo di un database che contiene i dati clinici, neurofisiologici e genetici di oltre 1500 pazienti.

La MAQ sarà utilizzata per la ricerca di CNVs

-          La tecnica consiste di un’amplificazione multiplex con primers con fluorocromi che identificano frammenti di diversa dimensione collocati nel gene in esame e in un gene di riferimento secondo criteri di distanza e di criticità delle regioni da analizzare.

-          I frammenti sono separati su elettroforesi capillare e il paragone dell’area dei picchi tra pazienti e controlli fornisce un quoziente dell’amplicon target

-          I risultati saranno confrontati con una diversa metodica (qPCR), attualmente in uso nel nostro laboratorio per diagnostica

Risultati attesi

Con questo progetto ci proponiamo di identificare CNVs come meccanismo patogenetico in pazienti con CMT e SLA, precedentemente analizzati mediante sequenziamento diretto di geni causali e risultati negativi a queste analisi. Le CNVs possono essere causa di malattia in pazienti attualmente privi di diagnosi molecolare, rappresentando quindi un nuovo meccanismo patogenetico. L’analisi per sequenziamento diretto e per ricerca di CNVs fornirà un’ulteriore informazione utile alla caratterizzazione dei pazienti.

Rilevanza per il Servizio Sanitario Nazionale

Attualmente sono disponibili differenti metodiche per la ricerca di CNVs in diagnostica. La CGH array e la MLPA sono diffusamente utilizzate.  La qPCR è utilizzata in minor misura per il costo elevato e la laboriosità del metodo. E’ comunque il metodo di scelta obbligata per l’analisi di delezione dei geni per i quali non esistono kit MLPA dedicati e nei laboratori di genetica molecolare, non attrezzati per analisi di tipo citogenetiche. In questi ultimi è ormai utilizzata la CGH array che però è una metodica costosa, laboriosa, che richiede strumenti dedicati ed un’elevata esperienza del personale che l’utilizza e ne interpreta clinicamente i risultati. I kit per MLPA sono di più largo utilizzo ma sono limitati dalla disponibilità commerciale, dal tempo di scadenza dei kit e quindi dai costi.

L’introduzione della MAQ nella routine della diagnostica molecolare del laboratorio di genetica consentirà di ridurre la laboriosità dei metodi attualmente utilizzati, nonchè i tempi di lavoro e i costi. Inoltre la MAQ è una metodica adattabile all’analisi di qualunque gene e consente quindi una ampia e rapida applicazione a tutti i geni di interesse di un laboratorio, completando l’analisi in sequenza diretta per la ricerca di mutazioni puntiformi con la ricerca delle CNVs. Gli strumenti necessari alla MAQ sono presenti in qualsiasi laboratorio di genetica molecolare. Per il suo costo ridotto e la velocità di esecuzione, l’applicazione di questa metodica può incrementare il tasso di identificazione di difetti genetici in queste frequenti patologie del sistema nervoso.